Изменение состава микробиома чернозема южного при влиянии систем земледелия и микробных препаратов

В настоящее время отмечена ориентация систем земледелия на ресурсосбережение. Развитие прямого посева (No-till) в степной зоне обеспечивает получение стабильного урожая при минимальных затратах , сохраняя при этом плодородие почвы, и является логическим продолжением существующей системы земледелия.

Многократное применение гербицидов при прямом посеве является существенным недостатком в экологической целесообразности системы. Задачу воспроизводства почвенного плодородия и повышения эффективности агроэкосистем во многом можно решить за счет приемов биологизации земледелия, включая и применение микробных препаратов.

Мировой опыт ведения земледелия показывает, что система земледелия прямого посева без обработки почвы (No-till) может эффективно использоваться в сельскохозяйственном производстве. Поэтому изучение целесообразности ее применения в засушливой зоне Республики Крым, где выпадает недостаточно осадков и возделывается ограниченное количество культур, весьма актуально и своевременно.

Микробиом почвы чувствителен к воздействию различных факторов, включая и системы земледелия, определяющие активность и направленность биологических процессов в агроценозах. Состояние микробоценоза почв дает объективную оценку их воздействия на агроэкосистемы. Многие микроорганизмы являются биоиндикаторами состояния почв и направленности происходящих в них процессов.

В настоящее время применение способа высокопроизводительного секвенирования гена 16S рРНК позволяет расширить знания о таксономической структуре микробиомов различных экологических ниш. Исследования, связанные с изучением состава микробных сообществ почвы, перспективны в решении задач экологической методологии по мониторингу потенциальных рисков различных факторов и прогнозирования возможности оптимизации и биологизации систем земледелия, в частности при No-till.

 

 

Цель данного исследования – изучение таксономической структуры почвенного микробиома чернозема южного при различных системах земледелия (традиционная и прямого посева) и применении комплекса микробных препаратов по сравнению с целинной почвой.

 

Методы исследования

Стационарный опыт по сравнительному изучению влияния микробных препаратов в условиях традиционной для степной части Крыма и каждой культуры пятипольного севооборота системе земледелия и прямого посева (No-till) заложен в 2015 г. на полях ФГБУН «НИИСХ Крыма» (с. Клепинино Красногвардейского района, 45°31'47.3"N 34°11'48.0"E). Севооборот при традиционной системе земледелия включал чистый пар, пшеницу озимую, лён масличный, ячмень озимый, сорго зерновое; при No-till имеется одно отличие – в первом поле горох посевной.

Комплекс микробных препаратов (КМП), разработанный под каждую культуру севооборота, применяли путем инокуляции семян. Образцы отобраны в июне 2018 г. с последнего поля севооборота.

Почва – чернозем южный малогумусный на лессовидных легких глинах. Мощность гумусового горизонта до 40 см, всего гумусового слоя – до 70 см. Количество гумуса (по Тюрину) – 2,00–2,20 %, подвижного фосфора (по Мачигину) – 4,00–4,20, обменного калия – до 40 мг на 100 г почвы.

Гранулометрический состав черноземов южных крупнолегкоглинистый пылевато-иловатый. Количество водостойких агрегатов размером более 0,25 мм в гумусовом горизонте целинных почв составляет 72–77 %. Содержание агрономически ценных агрегатов размером более 1 мм составляет 33–42 %.

Плотность сложения (объемная масса) в пахотном слое 1,14–1,28, а в подпахотном – 1,33–1,48 г/см3. Изменение показателей общей пористости происходит возвратнопропорционально изменению плотности сложения. Общая пористость верхних горизонтов составляет 50,2 %, что по агрономической оценке является удовлетворительным показателем. Водоудерживающее свойство почв достаточно высокое, они могут накапливать больше 300–350 мм влаги, но запасы продуктивной влаги, доступной для растений, всего лишь 160–180 мм.

В качестве эталона отобраны образцы участка целинной степи, доля злаковых компонентов на котором составляет около 80 %. На поверхности почвы развит мощный слой подстилки, толщина которого достигает в среднем 15 см.

Климат степной зоны засушливый, гидротермический коэффициент (ГТК) составляет 0,7, умеренно жаркий, с умеренно мягкой зимой. Среднегодовая температура воздуха 9,7–10,5 °С. В июле, в полдень, температура повышается до 28,9–30,2 °С, а в некоторые годы – до 40–42 °С. Средний минимум годовых температур находится в пределах от –19 до –23 °С. Зимой возможно понижение температуры до –31 °С. Вегетационная оттепель возможна в 35 % зим. Период без заморозков – 171 день. Сумма температур выше 10 °С достигает 3280 °С. Годовая сумма осадков – 435 мм, из них в период активной вегетации выпадает 285 мм. Годовая испаряемость – 843 мм. Преобладают восточные (22 %) и северо-восточные (20 %) ветры. Сильный ветер бывает 28–30 дней в году. Количество дней с суховеями – 10–19. Вероятность засух для большей части территории составляет 40–50 % лет.

Для изучения таксономической структуры микробиома почвы использовали высокопроизводительное секвенирование библиотек гена 16S рРНК. ДНК из почвенных образцов выделена с помощью набора PowerSoil DNA Isolation Kit (MoBio, США) по протоколу производителя для гомогенизации образцов использовали Vortex Genee-2 (Mo-Bio, США). Очистку ДНК проводили электрофоретически с последующей экстракцией из агарозного геля. Очищенную ДНК использовали в качестве матрицы в реакции ПЦР при создании ампликонных библиотек также применяли универсальные праймеры к вариабельному участку V4 гена 16S рРНК – F515 (GTGCCAGCMGCCGCGGTAA) и R806 (GGACTACVSGGGTATCTAAT). Секвенировали с помощью MySeq (Illumina, США) на базе ресурсного центра «Генетические технологии» Санкт-Петербургского университета. Использован таксономический и статистический анализ полученных результатов с использованием пакетов программ Bioconda [19], QIIME [20], PAST Paleo и базы данных Ribosomal Database Project (RDP).

Результаты исследования

Исследования микроорганизмов различных эколого-трофических групп чернозема южного исследуемого севооборота при использовании общепринятых методов показали, что системы земледелия влияют на численность микроорганизмов, микробные препараты способствуют её увеличению и биологической активности почвы. Использование в исследованиях метагеномного подхода позволяет учитывать наряду с культивируемыми и некультивируемые микроорганизмы.

По результатам высокопроизводительного секвенирования библиотек гена 16S рРНК в черноземе южном представители домена Bacteria доминировали над Archaea, что характерно для черноземов (рисунок 1). При этом доля архей значительно выше (в 1,5 раза) при традиционной системе земледелия, чем при прямом посеве, что согласуется с опубликованными данными исследований черноземов. Применение комплекса микробных препаратов способствовало увеличению их доли при обеих системах земледелия. Среди мажорных компонентов микробиома выявлены представители неатрибутируемого домена прокариот, доля которого составляла 2,8–3,5 %. 

Доминировали среди прокариот чернозема южного представители 10 фил, доля которых составила более 1 %. Домен археи представлен Crenarchaeota, бактерии − Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Firmicutes, Gemmatimonadetes, Planctomycetes, Proteobacteria и Verrucomicrobia. Представленность Actinobacteria была максимальной среди фил, а среди исследуемых образцов – в целинной почве (35,4 %). Доля их в условиях прямого посева составила 27,9 % и увеличивалась до 30,4 % при внесении КМП, тогда как при традиционной системе земледелия отмечено уменьшение с 29,1 до 26,3 %. Такое доминирование её представителей может быть связано со сроками отбора, учитывая их приспособленность к сухим условиям. Доля филы Proteobacteria составила в целине 23,1 %, на таком же уровне при прямом посеве и несколько выше – 26,4 % при традиционной системе и 25,6 % с применением КМП. Наименьшее количество в образцах целины было представителей филы Bacteroidetes – 6,2 %, их доля при обеих системах земледелия оставалась на одном уровне. Применение комплекса микробных препаратов способствовало при прямом посеве снижению их доли с 10,2 до 8,2 %, а при традиционной системе – ее увеличению с 9,9 до 11,1 %.

Археи, прежде всего Crenarchaeota, распространены в почве, их представленность выше в почвах с более низкими отношениями C:N. Доля архей филы Crenarchaeota в целинной почве составила 7,3 % и близкой к ней была почва прямого посева с применением КМП (7,5 %), при 6,2 % без КМП. В условиях традиционной системы представленность этой филы была выше и составила 9,2 %, также отмечено увеличение с применением КМП (9,7 %).

Среди экологически значимых функций ацидобактерий известна их способность реагировать на содержание макро- и микроэлементов почвы и её кислотность. Самая низкая представленность была у филы Acidobacteria и составляла в целинной почве 5,4 %. При традиционой системе отмечено увеличение их доли с 6,4 до 7,1 % при внесении КМП. Обратные тенденции её снижения – с 7,2 до 6,2 % установлены на прямом посеве.

Представленность филы Chloroflexi на максимальном уровне отмечена в целинной почве (5,1 %). Системы земледелия способствовали снижению их доли до 3,7 %, применение КМП на прямом посеве показало увеличение до 4,1 %, тогда как на традиционной системе выявлены тенденции к снижению.

Доля представителей филы Gemmatimonadetes находилась на одном уровне на участках целины и прямого посева (4,1–4,5 %), снижалась в почве традиционной системы (3,4 и 3,2 %). Возможно, это связано с более резкими перепадами влажности в почве, поскольку известно, что эти бактерии реагируют снижением на такие условия.

Бактерии филы Planctomycetes участвуют в разложении растительных остатков и чувствительны к рН почвы. В целинной почве их представленность была максимальной и составила 4,3 %, при традиционной системе земледелия – 3,8 % и 3,0 % – при прямом посеве.

Известно, что фила Firmicutes в пахотных почвах представлена бактериями, способными разлагать сложные органические вещества. Представленность филы Firmicutes в наших исследованиях отмечена на одном уровне (около 2,5 %) в целинной почве и при традиционной системе земледелия, в условиях прямого посева её доля составила 3,5 %, применение комплекса микробных препаратов способствовало увеличению до 3,9 %.

Сообщества представителей филы Verrucomicrobia являются индикаторами изменений количественного состава макроэлементов почвы. Представленность этой филы в образцах целины, прямого посева и его с КМП находилась в близких значениях – 1,4; 1,8; 1,6 % соответственно. В условиях традиционной системы земледелия их доля составила 3,6 %, а с применением КМП ещё выше – 4,4 %. Агрохимический анализ показал значительное превышение содержания NO3 и Р2О5 в почве традиционной системы земледелия, что и повлияло на представленность Verrucomicrobia.

Среди минорных компонентов прокариотного ризосферного биома следует отметить, что доля представителей Euryarchaeota в условиях прямого посева с КМП была выше в 1,9 раза, чем без КМП, и в 3,2 раза, чем в целине, тогда как при традиционной системе земледелия их не выявлено. Представители бактериальной филы AD3 выявлено только при применении КМП в традиционной системе земледелия, где их доля составила 0,002 %, тогда как Fusobacteria – только в целинной почве. Представительство Chlamydiae в целине составило 0,007 %, при прямом посеве оно увеличилось в 2,1 раза, в условиях традиционной системы – в 10,8 раза.

В прокариотном биоме чернозема южного определено 455 семейств (рисунок 2).

Среди микрооганизмов-индикаторов почвенных условий при агрогенном воздействии присутствуют представители семейств Micrococcaceae, Geodermatophilaceae и Rhodospirillaceae, доля которых увеличивается в пахотных почвах по сравнению с залежью. Результаты исследований чернозема южного стационарного опыта показали также увеличение доли представителей этих таксонов при традиционной системе земледелия по сравнению с прямым посевом. Применение микробных препаратов способствовало увеличению доли Geodermatophilaceae и Rhodospirillaceae, при традиционной системе земледелия, доля Micrococcaceae увеличивалась при обеих системах земледелия. Максимальная доля Sphingomonadaceae, также относящихся к этой группе индикаторов, отмечена при традиционной системе земледелия только под влиянием микробных препаратов и составила 3,0 %, как и в целине, при 2,2 % в условиях прямого посева. Представители Gemmatimonadetes также преобладают в пахотных почвах по сравнению с залежью. В черноземе южном доля неатрибутируемого семейства этой филы была в 1,5 раза ниже в условиях прямого посева, что согласуется с данными М. Favaz относительно влияния этой системы земледелия на содержание Gemmatimonadetes в почве.

К группе микрооганизмов-индикаторов почвенных условий при агрогенном воздействии, доля которых уменьшается в пахотных почвах по сравнению с залежью, принадлежат представители семейства Hyphomicrobiaceae. В черноземе южном их представленность в условиях традиционной системы земледелия в 2,2 раза ниже, чем при прямом посеве, где она составила 1,4 %.

Группу коровых (консервативных) компонентов черноземных почв составляют многочисленные семейства, среди них Sinobacteraceae и Bradyrhizobiaceae, доля которых не изменялась под влиянием систем земледелия в черноземе южном, тогда как доля Comamonadaceae и Nocardioidaceae увеличивалась при прямом посеве.

Увеличением на внесение минеральных удобрений реагируют семейства Nitrososphaeraceae, Chitinophagaceae и Bacillaceae. Наиболее высокое содержание азота и фосфора в почве при традиционной системе земледелия, как и представительство этих семейств, отмечено в черноземе южном.

Семейство Rubrobacteraceae является индикатором экстремальных условий в почве. В стационарном опыте доля представителей этого семейства в черноземе южном была максимальной при традиционной системе земледелия и составила 4,1 %, тогда как в условиях прямого посева представленность этого семейства была меньшей и составила 3,1 %, в целине – 3,5 %.

Показателем богатой среды и благоприятных почвенных условий служат бактерии семейства Chthoniobacteraceae. Максимальная доля их представителей в черноземе южном отмечена при прямом посеве 2,5 % и применение микробных препаратов способствовало её увеличению до 3,0 %, тогда как при традиционной системе земледелия уменьшение составило в 2,2 и 3,5 раза соответственно.

Количество выявленных семейств по обеим системам земледелия и применению КМП отличалось незначительно от показателей в целине и варьировало в пределах 307,0–321,0 ОТЕ (таблица 1). В условиях этого года система прямого посева имела более стабильную популяционную структуру, чем традиционная. Об этом свидетельствует рассчитанное альфа-разнообразие на уровне семейств, представленное показателями индекса Шеннона, где отмечено значительное превышение в условиях прямого посева, по сравнению с традиционной системой, при этом незначительно отличаясь от целины. Ежегодное применение активных штаммов полезных бактерий способствовало изменению бета-разнообразия чернозема южного: снижению при прямом посеве на 9,7 % и увеличению при традиционной системе земледелия на 36,0 %. 

Индекс бета-разнообразия Уиттакера уменьшился на 28,6 % при традиционной системе по сравнению с целинной почвой и в 1,7 раза – с прямым посевом. Применение комплекса микробных препаратов способствовало его увеличению на 36 % в условиях традиционной системы и снижению на 9,7 % при прямом посеве.