Во многих случаях почва селитебных территорий и агроценозов – это своеобразное депо и аккумулятор, обеспечивающий длительное сохранение возбудителей опаснейших болезней человека, домашних животных и культивируемых растений.
Продолжительность сохранения патогенов в жизнеспособном состоянии определяется самоочищающей способностью почвы – ее совокупными физико- химическими, биохимическими, супрессивными и иными генетическими свойствами.
Первоисточник патогенных микроорганизмов в почве – выделения продуктов жизнедеятельности людей и животных (больных и/или носителей инфекции). Заселенная патогенами почва представляет реальную опасность не только для здоровья людей, но и для сопряженных сред – поверхностных водоисточников, приземной атмосферы, продуктов урожая. Для почв селитебных территорий источником патогенных бактерий в ряде мест являются несанкционированные свалки ТБО. Для почв сельскохозяйственных угодий постоянную угрозу представляют неочищенные стоки, некомпостированные отходы животноводства и продукты жизнедеятельности человека, используемые в качестве местных органических удобрений. Их повсеместное обеззараживание и утилизации должны стать обязательной частью региональной социально-экологической политики.
Оценка санитарного состояния почвы базируется на выявлении в ней санитарно-показательных микроорганизмов (СПМ). Их наличие свидетельствует о загрязнении почвы выделениями человека и теплокровных животных, а их численность – о степени такого загрязнения. Индексы и титры санитарных показателей, таких как общие и термотолерантные колиформные бактерии, энтерококки, сульфитредуцирующие клостридии, сальмонеллы, энтеровирусы и др., характеризуют чистоту почвы и степень ее биогенного загрязнения.
Перечни СПМ, их допустимое содержание в почве, методы выявления, а также оценка антипатогенной (супрессивной) активности почвы регламентируются международными и/или федеральными нормативными документами. Для выявления СПМ официально рекомендованы как традиционные (классические), так и современные ускоренные методы микробиологических исследований. В числе последних достижений – автоматизированные методы пробоподготовки, посева и учета численности микробных колоний, хромогенные среды и готовые тест-системы (петрифильмы), прецизионные молекулярные методы выявления патогенов – ИФА-экспресс-тесты Singlepath, система мо- лекулярного детектирования (MDS).
В данной статье мы продолжаем рассматривать основные факторы заселения и выживания в почве патогенных микроорганизмов, методы их выявления и профилактики (начало в №1 за 2019 г. ), и начнем с краткой характеристики наиболее значимых микробиологических показателей.
Показатели группы кишечных палочек
Присутствие в наименовании разных СП названия одного и того же СПМ (в частности, кишечной палочки) порождает неразбериху в восприятии и оценке значимости конкретного СП.
Тем не менее, даже при санитарно-микро биолог ическом нормировании почвы и регламентации санитарно-гигиенических требований к одному и тому же биоагенту в разных официальных документах до сих пор отсутствует единый подход.
Так, согласно нормативным документам, показатель, подразумевающий определение численности энтеробактерий в почвенном образце, именуется «БГКП», или же это «кишечные палочки», хотя ни то, ни другое название не отражает сути обсуждаемого показателя.
Показатель БГКП (бактерии группы кишечных палочек) в его традиционном понимании – это грамотрицательные палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидазой и способные расти на среде Эндо (дифференциальная лактозная среда с солями желчи), которые при 37 °С за 24 ч сбраживают глюкозу до кислоты и газа.
Подозрительными на БГКП считаются все колонии (любого оттенка с отпечатком или без, с металлическим блеском или без), кроме сухих, пленчатых, морщинистых или склонных к ползучему росту. Однако этими свойствами обладают практически все представители семейства Enterobacteriacea (кроме представителей негазообразующих родов – Shigella, Hafnia и некоторых других). Поскольку в данное семейство входит много сапрофитов и эпифитов, прекрасно размножающихся в окружающей среде в отсутствие хозяина, интегральный показатель численности БГКП не может рассматриваться в качестве корректного показателя фекального загрязнения.
В свою очередь, к E. coli (кишечной палочке) будут относиться грамотрицательные палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидазой, дающие типичный рост на среде Эндо, способные сбраживать лактозу до кислоты и газа при 44 °С за 24 ч и образовывать индол на среде с триптофаном. Именно эта бактерия, по ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения - World Health Organization) является индексным, а не индикаторным показателем, свидетельствующим о свежем фекальном загрязнении.
На самом же деле, если проанализировать тексты методик, данный показатель является ничем иным, как колиформными бактериями, согласно международной практике, или же общими колиформными бактериями (ОКБ) или лактозоположительными кишечными палочками (ЛКП), согласно отечественной практике. Правда, во второй из них даются необходимые разъяснения по поводу того, что «Показатель «бактерии группы кишечных палочек» (БГКП) приведен соответствие с принятой международной номенклатурой и идентичен показателю «общие колиформные бактерии» (ОКБ)».
К колиформам относятся грамотрицательные бактерии, имеющие форму палочек, способных развиваться в присутствии солей желчных кислот или других поверхностно-активных агентов с аналогичной способностью к подавлению роста и способных ферментировать лактозу при t (35–37 °C) с образованием кислоты, газа и альдегида.
БГКП (ОКБ) включают следующие роды: эшерихия, клебсиелла, энтеробактер, цитробактер и серрации. В настоящее время список бактерий, входящих в состав показателя ОКБ, расширился.
Выбор метода определения ОКБ зависит, прежде всего, от степени предполагаемого загрязнения почвы. При анализе почв с умеренной степенью фекального загрязнения рекомендуется использовать титрационный метод. Для ускоренного анализа слабозагрязненных почв рекомендуется метод мембранной фильтрации. Анализ проб с высокой степенью фекального загрязнения проводится прямым поверхностным посевом разведения почвенной суспензии на поверхность среды Эндо.
Основной плотной дифференциальной средой для определения колиформных показателей в отечественных методиках является среда Эндо. Однако в последних редакциях стандартов ISO (например, ISO 9308-1:2000) среда Эндо заменена другой лактозной средой, включающей Тергитол 7. Причиной такой замены является потенциальная канцерогенность фуксина – анилинового красителя, входящего в состав среды Эндо. Для титрационного метода используют жидкие среды обогащения (Кесслера или ее аналоги). В последние годы широкое распространения получили питательные среды нового поколения, именуемые «хромогенными». В отличие от традиционных сред они позволяют идентифицировать не признак патогена (например, утилизацию лактозы), а конкретные ферменты микроорганизма. Хромогенные среды для идентификации E. coli, например Chromocult или Coli ID, позволяют определять фермент β-глюкуронидазу, высокоспецифичный для эшерихий. Наличие этого фермента и способности образовывать индол с 95%-ной вероятностью свидетельствует о принадлежности энтеробактерий к виду E. coli. Эти же среды позволяют определять и β-галактозидазу, характерную для ОКБ.
Ценность этого диагностического теста, однако, сомнительна, так как данным ферментом обладают и аэромонады – свободноживущие оксидазоположительные палочки, не относящиеся к ОКБ. Компания Merck усовершенствовала хромогенную среду Chromocult EC, включив в нее селективную добавку, ингибирующую рост аэромонад.
Из инновационных технологий, до недавнего времени преимущественно используемых в области санитарной бактериологии воды, отметим петрифильмы – тест-системы с сухими средами на специальных пластиковых подложках. Примером таких тест-систем, используемых для идентификации колиформ (ОКБ, ТКБ), являются две марки петрифильмов 3МТМ – СС и HSCC. Их уникальность заключается в простоте использования: исключается трудоемкий этап приготовления питательных сред, облегчаются хранение и утилизация использованных тест-систем.
Однако их главное преимущество перед традиционными средами и петрифильмами других производителей заключается в том, что петрифильмы 3МТМ уже на этапе первичного посева при получении изолированных колоний позволяют определять не только их способность утилизировать лактозу до кислоты, но и выявлять газообразование бактерий. Это позволяет в большинстве случаев сократить анализ до 1–2 суток. Кроме того, петрифильмы (в отличие от среды Эндо) можно инкубировать при 44 °С, что позволяет в полной мере использовать селективный фактор высокой температуры уже на этапе первичного посева. Все это существенно сокращает время и трудоемкость анализа на ТКБ.
Индекс энтерококков
Энтерококки (род семейства Enterococcaceae) – грамположительные, не образующие каталазу кокки; они полиморфны, слегка вытянутые, с заостренными концами, располагающиеся в виде диплококков или коротких цепочек, реже одиночно. По физиологическим характеристикам бактерии очень близки к стрептококкам. Основными симбионтами микрофлоры кишечника человека являются два вида энтерококков: E. faecalis (90–95%) и E. faecium (5–10%).
Энтерококки– постоянные обитатели кишечника человека и теплокровных животных. Как и кишечная палочка, они не размножаются в почве и воде, но более устойчивы к всевозможным физическим и химическим воздействиям, в частности, к действию повышенных концентраций солей, колебаниям рН, нагреванию до 60 °С, хлорированию. Это позволило использовать энтерококки не только как показатель свежего фекального загрязнения, но и как важный технологический показатель чистоты различных объектов.
При исследовании почвы энтерококки имеют преимущество перед кишечной палочкой. В их пользу как СПМ свидетельствует также наличие высокоселективных сред для их выявления. Энтерококк введен как дополнительный СП фекального загрязнения воды: с 1958 г. – в Международный стандарт ВОЗ по исследованию питьевой воды, с 1960 г. – в стандарт США по исследованию питьевой и сточной воды, с 1963 г. – в Европейский стандарт ISO. В международном стандарте подчеркнуто, что при обнаружении в исследуемых объектах атипичных (лактозоотрицательных) кишечных палочек наличие или отсутствие энтерококка является решающим для суждения о наличии или отсутствии фекального загрязнения.
Согласно рекомендациям ВОЗ, в последнее время рекомендуется определять не групповой по казатель – «энтерококки» (Enterococcus faecalis, E. faecium, E. durans), а непосредственно санитарнопоказательный вид Enterococcus faecalis.
В отечественной нормативной базе определение энтерококков рекомендуется при контроле качества обеззараживания сточных вод, санитарного состояния почвы и ряда пищевых продуктов.
Определение энтерококков проводится как прямым, так и титрационным методами (НВЧ). При прямом определении широко используется метод мембранной фильтрации. Для выделения энтерококков с одинаковой эффективностью может использоваться энтерококковый агар – азидная среда с ТТХ (трифенилтетразолий хлористый), либо щелочной агар с полимиксином. В качестве жидкой среды обогащения для метода НВЧ используется щелочной бульон с полимиксином. Рекомендуются также молочно-ингибиторная среда и желточная среда Турчинского.
Споры сульфитредуцирующих клостридий и Clostridium perfringens
Сульфитредуцирующие клостридии (СРК) – это крупные облигатно анаэробные грамположительные спорообразующие палочки, у которых диаметр спор превышает диаметр вегетативной клетки. Данная группа клостридий обладает свойством восстанавливать сульфиты до сульфидов, что используется при их идентификации. Считается, что способностью редуцировать сульфиты обладают только споровые анаэробы кишечного происхождения, что позволило выделить эту группу микроорганизмов как санитарно-показательную. Доминирующим представителем СРК является Clostridium perfringens. Эта бактерия является постоянным и нормальным обитателем кишечного тракта, хотя по численности она значительно уступает E. coli. Споры СРК и Clostridium perfringens в частности обладают высокой устойчивостью в окружающей среде, поэтому их обнаружение в почве свидетельствует о некогда имевшем место фекальном загрязнении. Однако с учетом того, что СРК способны при благоприятных условиях размножаться в окружающей среде (и особенно в почве), их ценность как показателя фекального загрязнения низкая. С другой стороны, высокая устойчивость спор к агрессивным воздействиям внешней среды и, в том числе, к дезинфицирующим и стерилизующим мероприятиям, делает споры СРК важным технологическим показателем, позволяющим оценить качество обеззараживания (например, почвосубстратов, воды, пищевых продуктов). При дефектах в технологии обеззараживания спорообразующие клостридии будут первыми из бактерий, кто преодолеет этот барьер. Кроме того, СРК относятся к индикаторным микроорганизмам, поскольку наличие их спор в почве будет указывать на возможное присутствие сходных по устойчивости цист и ооцист простейших и яиц гельминтов.
В РФ количественный учет спор СРК предусмотрен при санитарных исследованиях почвы, лечебных грязей, воды открытых водоемов, контроле качества водоподготовки. При контроле почв данный показатель именуется перфрингенс-титром. Перфрингенс-титр – это наименьшее весовое количество почвы (г), в котором обнаруживаются жизнеспособные клетки C. рerfringens. Для выявления спор СРК и Clostridium perfringens чаще всего используют железосульфитный агар (среду Вильсон-Блер), реже – среду Китта-Тароции.
СРК и Clostridium perfringens в сравнении с другими споровыми анаэробами являются менее строгими анаэробами, что позволяет выращивать их в аэробных условиях с использованием редуцированных сред (прогретых до 75 °С и быстро охлажденных). Нагревание приводит к снижению растворимости газов, в результате чего кислород покидает питательную среду, а быстрое охлаждение не позволяет ему вновь насытить ее.
В настоящее время для выделения и учета спор СРК используют высокочувствительные и высоко- специфичные коммерческие среды, содержащие соли тиогликолевой кислоты и добавки антибиотиков, например SPS-агар. Соли тиогликолевой кислоты обеспечивают более высокую степень анаэробиоза, благодаря чему повышается чувствительность метода, а добавка антибиотиков повышает его специфичность.
Определение проводят прямым глубинным посевом в пробирках, двухслойным чашечным методом, методом мембранной фильтрации или методом НВЧ. Благодаря редукции сульфитов на железосульфитном агаре и сходных средах СРК и Clostridium perfringens образуют колонии в виде черных пушинок или комочков ваты.
Для идентификации Clostridium perfringens дополнительно определяют подвижность клеток, каталазную активность, редукцию нитратов, утилизацию лактозы, разжижение желатина и «штормовую реакцию» (при росте на лакмусовом молоке). Бактерии грамположительны, сбраживают лактозу, редуцируют нитраты в нитриты, как правило, разжижают желатин, на лакмусовом молоке дают выраженную «штормовую реакцию», лишены каталазной активности. Clostridium perfringens – это важный критерий для оценки санитарного состояния почвы, ее самоочищающей способности.
Установлено, что в загрязненной фекалиями почве уже через 4–5 месяцев исчезают БГКП, а C. рerfringens обнаруживаются в титре 0,01 г. Следовательно, перфрингенс-титр позволяет объективно судить о давности фекального загрязнения.
Потенциально патогенные микроорганизмы
Эта группа показателей включает оценку численности патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, обнаруживаемых в различных объектах окружающей среды. Некоторые из них, например сальмонеллы, будучи патогенами, в то же время свидетельствуют о фекальном загрязнении почвы, являясь, по сути, СПМ – индикатором возможного наличия в почве других болезнетворных микроорганизмов. Отдельные представители данной группы для одних объектов являются СПМ, а для других – потенциально патогенными (C. perfingens, B. cereus и др.).
Сальмонеллы попадают в почву и другие объекты внешней среды только с фекалиями человека и животных. Поэтому их наличие в исследуемом субстрате свидетельствует о его фекальном загрязнении. Вне организма эти бактерии обычно не способны к рамножению (за исключением пищевых продуктов).
С учетом того, что сальмонеллы являются еще и одними из самых распространенных возбудителей острых кишечных за- болеваний, их относят к важным СПМ – индикаторам возможного присутствия в почве других болезнетворных бактерий со сходным патогенезом (шигелл, диареегенных эшерихий и др.).
В большинстве случаев определение сальмонелл в почве проводят качественным методом. Поскольку их в почве заведомо меньше, чем сопутствующей микрофлоры, все методики определения сальмонелл включают обязательный этап их селективного обогащения в жидких элективных средах (селенитовый бульон, магниевая или тетратионатная среды и др.). Селективное обогащение выполняется не менее чем на двух разных средах.
После обогащения исследуемый материал высевается, как минимум, на две плотные дифференциальные среды, например, SS-агар и висмут-сульфитный агар. На среде с SS-агаром, помимо способности бактерий утилизировать лактозу (сальмонеллы лактозоотрицательны), определяется их способность образовывать сероводород (колонии таких микроорганизмов имеют черный центр). Среди лактозоотрицательных микроорганизмов, кроме сальмонелл, сероводород образуют только протеи, провиденции и некоторые другие. На висмутсульфитном агаре сальмонеллы в большинстве случаев образуют темно-серые или черные колонии с черным отпечатком под колонией и темным ореолом. Типичные для сальмонелл колонии идентифицируют по биохимическим и антигенным свойствам.
В настоящее время известны новые, более эффективные дифференциальные среды для выделения сальмонелл. В их числе XLT-4 агар, на котором подавляется рост протея, что крайне важно при исследовании почв, или хромогенный Rambach-агар.
Недавние инновационные разработки в данной области позволили существенно сократить время анализа. Так, петрифильмы (3M™ Petrifilm™ Salmonella Express System, SALX) позволяют выявлять сальмонеллы в 2–3 раза быстрее в сравнении с классическим методом.
Показатели биологической активности почвы
Исследования по биологической активности почвы проводятся с целью углубленной оценки ее санитарного состояния и способности к самоочищению.
Основными интегральными показателями биологической активности почвы являются: общее микробное число (ОМЧ), численность основных групп почвенных микро- организмов (сапротрофных бактерий, актиномицетов, микромицетов), показатели интенсивности трансформации соединений углерода и азота («дыхание» почвы, «санитарное число», динамика аммиака и нитратов, азотфиксация, аммонификация, нитрификация, денитрификация), активность ферментативных систем, динамика кислотности, ОВП, другие показатели.
Перечень конкретных показателей биологической активности почвы определяется целями исследования, природой и интенсивностью загрязнения, характером землепользования. На первом этапе исследований целесообразно использовать наиболее простые и ускоренно определяемые информативные интегральные показатели: «дыхание» почвы, ОМЧ, рН и ОВП, динамику аммиака и нитратов. Дальнейшая более углубленная оценка проводится в соответствии с полученными результатами и конкретными задачами исследования.
Протоколы оценки биологической активности почвы приведены в «Методических указаниях по гигиеническому обоснованию ПДК химических веществ в почве»» (от 05.08.82 № 2609-82). Так, по показателям биологической активности почву относят к «не- загрязненной» при изменениях (в сравнении с чистой здоровой почвой аналогичного типа) микробиологических показателей до 50%, биохимических показателей – до 25% .
Чистая, здоровая почва характеризуется эталонной динамикой важнейших интегральных биологических процессов, таких как: гетеротрофная активность (интенсивность почвенного дыхания), трансформация соединений азота, способность к самоочищению (от ксенобиотических и природных поллютантов) и др.
Оценка антипатогенных свойств почвы
Самоочищение почвы от болезнетворных микроорганизмов может происходить при воздействии на них неблагоприятных факторов среды, отсутствии необходимого питательного субстрата и, что немаловажно, вследствие антагонистического воздействия других геобионтов – бактериофагов, бактерийпаразитов, грибов, простейших, корневых экссудатов. Интересно, что в ризосфере ряда растений происходит либо более быстрое отмирание патогенов, либо, напротив, сроки их выживания возрастают.
Определение антипатогенных свойств почвы в отношении целевых групп болезнетворных микроорганизмов предложено использовать в качестве ускоренного ориентировочного и достаточно чувствительного теста.
Метод позволяет получать предварительные сведения о способности почвы самоочищаться от патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Низкая степень ингибиторного действия почвы в отношении патогенных микроорганизмов (либо динамика его снижения) свидетельствует об условиях, способствующих выживанию возбудителя. Антипатогенная способность почвы классифицируется по 5-балльной шкале: 1 – 0÷20% колоний выживших патогенов – супрессивная почва, 5 – 81÷100% этих колоний – абсолютно кондуктивная почва.
Антипатогенные свойства почвы оценивают качественным и полуколичественным методами. В последнем случае по всей поверхности дна стерильной чашки Петри равномерно вносится 10 г исследуемой нативной почвы. Затем поверхность почвы в чашке заливают 10 мл расплавленного и остуженного голодного агара. Для выявления исследуемого тест-патогена после застывания агара на него наслаивают 10 мл расплавленной и остуженной питательной среды. На поверхность застывшей питательной среды помещают подготовленный мембранный фильтр. На его поверхность в местах, заранее отмеченных точками, высевают тест-организм, суспензированный в изотоническом растворе NaCl с титром ~108/мл бактериальных клеток. Условия культивирования подбирают с учетом потребностей оцениваемого патогена. Результаты учитывают, подсчитывая выросшие колонии в точках посева. Процент пророста (выход, Р) рассчитывается как количество выросших колоний к количеству посевов. Токсичность почвы (Т%) рассчитывают по формуле: Т = 100 – Р. Метод позволяет установить абсолютную токсичность или супрессивность почвы (если не вырастает ни одна колония), отсутствие токсичности (на местах всех посевов вырастают колонии) и различную степень токсичности (прорастает только часть засеянных точек).
Результаты оценки самоочищающей (супрессивной) способности почвы в отношении целевых болезнетворных микроорганизмов позволяют предварительно характеризовать антипатогенные (самоочищающие) свойства почвы.
Здоровая, чистая, супрессивная почва способна (в определенных пределах) к элиминированию заселяющих ее патогенных микроорганизмов. Усилия землепользователей должны быть направлены на поддержание и интенсификацию ее самоочищения – этого уникального природного феномена.
